Nat Commun︱刘亮课题组揭示四膜虫DNA 6mA甲基化的分子机制
撰文︱陈霁云
责编︱王思珍
编辑︱查佳雪
DNA N6-腺嘌呤甲基化（6mA）是一种普遍存在于原核生物中的甲基化修饰，在细菌R-M限制性修饰系统中起到了关键作用。对真核生物而言，相比5mC的广泛研究，DNA 6mA 甲基化的研究仍处在早期阶段。近年来，研究发现DNA 6mA甲基化以很低的峰度存在于多种真核生物中，其中包括高等植物和哺乳动物[1,2]。其在真核生物系统中的功能逐渐显现，包括基因调控、跨代表观遗传、染色质组成、胚胎发育、压力应激、肿瘤形成[2-5]。目前，受检测技术的制约，多细胞真核生物中 DNA 6mA甲基化的来源仍存在争议。相较于此，早期研究就已经发现，6mA 甲基化修饰广泛存在于单细胞真核生物基因组中，其中包括纤毛虫（0.18%-2.5%）、绿藻（0.3%-0.5%）等。最近研究表明，在嗜热四膜虫和莱茵衣藻中，6mA甲基化主要分布于基因组的转录起始区域，在染色质重塑以及核小体占位中发挥了关键作用[2]。2019年，哥伦比亚大学Laura F. Landweber 的研究团队在纤毛虫中确定了首个真核生物的DNA 6mA 甲基转移酶复合体—MTA1c。该复合体由MTA1、MTA9、p1、p2四个蛋白组成。研究发现，MTA1c 可以特异性甲基化双链DNA中的ApT二核苷酸，且催化位点主要位于核小体间隔的中间区域。但是，MTA1c 是如何特异性识别底物以及该复合物是如何介导6mA 催化的分子机制并不清楚。
2022年6月7日，厦门大学细胞应激生物学国家重点实验室、厦门大学生命科学学院刘亮教授课题组在Nature Communications上发表了题为“Structural basis for MTA1c-mediated DNA N6-adenine methylation”的研究。研究团队通过解析多个MTA1c相关复合物的结构，并结合大量生化实验，揭示了MTA1c催化真核生物DNA 6mA甲基化修饰的分子机制。
DNA甲基转移酶作为DNA 6mA甲基化修饰过程中的关键蛋白，对研究DNA 6mA甲基化的生理功能具有重要意义。目前，对于多细胞真核生物而言，其细胞内的DNA 6mA甲基转移酶并未得到充分确定，这也大大限制了本领域的研究进展。四膜虫内DNA 6mA 甲基转移酶MTA1c的确定，对进一步研究真核生物DNA 6mA甲基化调控具有关键作用。为研究MTA1c介导DNA 6mA甲基化修饰的分子机制，研究人员首先通过生化实验证实MTA1可以分别与MTA9、p1、p2相互作用从而驱动四元复合体的组装。进一步解析结构发现，MTA1 N端的Helical结构域像一只伸出的手臂牢牢“抓”住了p1和p2蛋白；而MTA1的MTase结构域与MTA9的MTase结构域通过氢键和疏水相互作用形成了广泛的相互作用。
为进一步研究MTA1c是如何识别其甲基供体，研究人员首先解析了MTA1-p1-p2分别与SAM和SAH的复合物的晶体结构（图1a,b）。通过结构发现，SAM和SAH通过大量的氢键结合在MTA1的SAM结合口袋内，而p1与p2蛋白结构内并未发现有配体的电子密度存在，结合ITC数据发现p1与p2不具备SAM的能力。
（图源：Chen J, et al., Nat Commun, 2022）
MTA1和MTA9同真核生物的RNA m6A甲基转移酶复合体METLL3-METTL14一样同属于MT-A70家族。METTL3 作为催化亚基，其最适功能的发挥往往依赖于METTL14的相互作用。研究人员通过结构比对发现，MTA1的MTase结构域与METTL3的MTase结构域具有很高的相似性，特别是在参与SAM识别的关键氨基酸残基上高度保守。考虑到MTA9与MTA1均含有MTase结构域，研究人员进一步测试了MTA1和MTA9的SAM结合能力。有趣的是，在ITC实验中，研究人员发现，单独的MTA1蛋白以及MTA1-MTA9二元复合物蛋白均未能检测到明显的SAM结合能力。与此不同的是，在不与METTL4结合的情况下，METTL3仍具备与SAM结合的能力。通过比对MTA1、MTA1-MTA9、MTA1-p2、MTA1-p1-p2的结构发现当MTA1与p2结合时，MTA1的SAM结合口袋相比于MTA1-MTA9复合物发生了明显的构象变化。在MTA1-MTA9复合物结构中，MTA1的357位精氨酸和370位的天冬酰胺的侧链朝向211位的脯氨酸，导致MTA1的SAM结合口袋被遮挡。当p2与MTA1结合时，p2的41位酪氨酸和44位苏氨酸的主链与MTA1的358位精氨酸的侧链相互作用，导致MTA1的loop1发生位移，使得SAM结合口袋被打开(图2a,b)。同时，ITC实验也证明在p2结合的情况下，MTA1具有与SAM结合的能力。综上，研究人员发现在不与p2结合时，MTA1处于自抑制构象，不与甲基供体—SAM结合；在与p2结合后，MTA1的自抑制构象解除。本研究首次发现，p2可以通过变构调节MTA1的SAM结合口袋来激活MTA1c复合物的甲基转移酶活性。这一机制，完全不同于以往报道的DNA/RNA甲基转移酶的催化机制。
（图源：Chen J, et al., Nat Commun, 2022）
另外，本研究发现，MTA1、MTA9、p1和p2通过结构组装，可形成一个特殊的DNA结合通道(图3)，且通过一系列关键突变体的EMSA及酶活实验证明四个蛋白均参与了对底物DNA的特异性的识别，但最终只由MTA1来催化甲基从SAM向DNA腺嘌呤N6位的转移。
（图源：Chen J, et al., Nat Commun, 2022）
综上，该工作首次解析了嗜热四膜虫DNA 6mA甲基转移酶复合体的原子结构，系统研究了MTA1c 催化真核生物DNA 6mA 甲基化的分子机制。该工作丰富了真核生物DNA 6mA甲基化调控以及6mA 修饰的认知，对于研究生物体DNA甲基化酶的功能和修饰具有重要的意义，同时为研究DNA 6mA甲基化参与真核生物基因表达调控等多个生命过程提供了重要的结构基础。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-31060-6
刘亮课题组助理教授陈霁云、2017级博士研究生胡荣、2020级硕士研究生陈莹、2020级硕士研究生林晓峰为本文的共同第一作者。刘亮教授为本论文的通讯作者。该研究得到了中国科协青年人才托举工程、国家自然科学基金和厦门大学高层次人才科研启动经费的资助。
通讯作者：刘亮
（图源：刘亮课题组）
通讯作者介绍：刘亮，厦门大学生命科学学院教授，博士生导师。2018年入选第四届中国科协“青年人才托举工程”；2019年入选厦门大学南强青年拔尖人才A类；2021年获国家优秀青年科学基金资助，主要研究方向为核酸加工与调控的机理研究。
【1】Cell Death Dis 综述︱任骏团队聚焦线粒体相关内质网膜调节细胞死亡在心血管疾病中的作用机制
【2】Frontiers Immunol︱李鹏团队揭示CCR8可作为治疗T细胞恶性肿瘤潜在的治疗靶点
【3】eLife︱吕红斌团队揭示力学刺激促进骨腱界面损伤修复新机制
【4】Cell Death Dis︱姚颖/曾锐教授团队发现Connexin 43有望成为延缓肾间质纤维化进展的新靶
【5】Cell Death Dis︱邹晓平/陆云杰团队合作发现肝再生新机制
【6】Nat Commun︱宋尔卫院士团队发现免疫联合抗血管及艾立布林三联治疗方案显著改善晚期三阴性乳腺癌预后
【7】Cell Death Dis︱李恩民/许丽艳课题组发现阻断STAT3信号通路可增强MEK抑制剂在食管鳞癌治疗的有效性
【8】Nat Commun︱马骏/柳娜/黎映琴/蒋伟团队发现一组与鼻咽癌免疫异质性相关的lncRNA标志物有效预测远处转移
参考文献（上下滑动阅读）
1. Greer, E.L., Blanco, M.A., Gu, L., Sendinc, E., Liu, J., Aristizabal-Corrales, D., Hsu, C.H., Aravind, L., He, C., and Shi, Y. (2015). DNA Methylation on N6-Adenine in C. elegans. Cell 161, 868-878.
2. Beh, L.Y., Debelouchina, G.T., Clay, D.M., Thompson, R.E., Lindblad, K.A., Hutton, E.R., Bracht, J.R., Sebra, R.P., Muir, T.W., and Landweber, L.F. (2019). Identification of a DNA N6-Adenine Methyltransferase Complex and Its Impact on Chromatin Organization. Cell 177, 1781-1796 e1725.
3. Fu, Y., Luo, G.Z., Chen, K., Deng, X., Yu, M., Han, D., Hao, Z., Liu, J., Lu, X., Dore, L.C., et al. (2015). N6-methyldeoxyadenosine marks active transcription start sites in Chlamydomonas. Cell 161, 879-892.
4. Hao, Z., Wu, T., Cui, X., Zhu, P., Tan, C., Dou, X., Hsu, K.W., Lin, Y.T., Peng, P.H., Zhang, L.S., et al. (2020). N(6)-Deoxyadenosine Methylation in Mammalian Mitochondrial DNA. Mol Cell 78, 382-395e388.
5. Kweon, S.M., Chen, Y., Moon, E., Kvederaviciute, K., Klimasauskas, S., and Feldman, D.E. (2019). An Adversarial DNA N(6)-Methyladenine-Sensor Network Preserves Polycomb Silencing. Mol Cell 74, 1138-1147 e1136.
本文完